信帆生物：western操作步驟
更新時間：2016-03-14 點(diǎn)擊次數(shù)：1091次信帆生物：western操作步驟
1.制膠及上樣：
(1)配制12%SDS-PAGE分離膠，混勻后注入邊條厚度為2mm的兩塊潔凈玻璃板間，其上加一薄層異丙醇，室溫下靜置至凝固。
(2)待分離膠*聚合后，傾去其上的水層，以吸水紙吸凈殘余液體，插入加樣梳，緩緩加入濃縮膠，使其充滿加樣梳間的空隙，室溫下靜置。待膠*聚合。
(3)將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩沖液。
(4)小心拔去加樣梳，使加樣孔豎直，以電泳緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。
(5)分別取50µg蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量marker，按4：1體積比加入5´樣品緩沖液，以1´樣品緩沖液?配平上樣體積(總體積20µ1)后，于沸水浴中煮3min使蛋白變性。
(6)將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入分離膠的上樣孔中。
2.電泳
(1)接通凝膠電泳儀的電源，初始電壓70V。(約30分鐘)
(2)溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至160V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠的下緣。(約60分鐘)
3.轉(zhuǎn)膜
(1)從玻璃板中取出凝膠，將其浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。
(2)取與膠同樣大小的硝酸纖維素膜，以95%乙醇浸泡5秒鐘后浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液5分鐘以上待用。
(3)按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。
(4)將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，膜在正極、膠在負(fù)極，接冷卻循環(huán)水，90V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移2小時。
4.染色
(1)將硝酸纖維素浸入麗春紅使用液中，振搖染色5-10min。
(2)蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)后，用去離子水洗去硝酸纖維膜上的麗春紅底色。
(3)按照蛋白質(zhì)分子量Marker指示的位置剪下目的條帶所在的硝酸纖維素膜。
5.封閉
把硝酸纖維素膜浸入5%脫脂奶粉，室溫?fù)u動2小時。
6.洗膜與雜交
(1)以T-TBS洗膜，10分鐘´ 3次。
(2)*抗體封閉： SPARC單抗以T-TBS 1：200稀釋，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，4℃振搖過夜。
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(3)以T-TBS洗膜，10分鐘´ 3次。
(4)第二抗體封閉：辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1：4000)，按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，室溫下振搖60分鐘。
(5)以T-TBS洗膜，10分鐘´ 3次。
7.化學(xué)發(fā)光與曝光
(1)將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動孵育1分鐘。
(2)用濾紙沾干膜上的液體，用保鮮膜包好，用感光膠片在壓片盒中曝光約1分鐘。
(3)曝光后的感光膠片在顯影液中顯影約30秒鐘，定影液中定影1分鐘，用水沖洗后晾干。
(4)根據(jù)曝光情況調(diào)整曝光時間，重復(fù)壓片、顯影及定影，選擇滿意的膠片。
(5)重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。
