溶菌酶的制備、純化和鑒定
更新時間：2017-02-27 點擊次數(shù)：2535次溶菌酶,全稱為1,4-β-N-溶菌酶,又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?屬于α-乳白蛋白家族。人們對溶菌酶的研究始于上世紀(jì)初,英國細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名為溶菌酶；此后人們在微生物、植物、無脊椎動物和高等動物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。其中雞蛋清溶菌酶的研究和應(yīng)用已相當(dāng)深入和廣泛。另外隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過人工合成基因，用微生物發(fā)酵生物試劑人溶菌酶的研究也正在深入進(jìn)行之中。
雞蛋清溶菌酶是由129個氨基酸殘基組成的堿性球蛋白,單一肽鏈，分子量為14388，分子內(nèi)含有4對二硫鍵。由于其含的堿性氨基酸殘基比酸性氨基酸殘基多，所以它的等電點高達(dá)11左右，等電點約為10.5~11，zui適溫度為50℃，zui適pH為6~7左右。雞蛋清中的溶菌酶的含量約占蛋白質(zhì)總量的3.4%~3.5%。
溶菌酶既是藥品又是保健品，還是生化藥物中理想的藥物酶，國外已經(jīng)開始利用于藥物制劑、食品和飲料的添加劑、生化試劑和醫(yī)學(xué)診斷劑等。溶菌酶在醫(yī)藥、食品防腐和生物工程中應(yīng)用非常廣泛。溶菌酶是一種糖苷水解酶，具抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用，上常用于五官科各種炎癥、扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣等各種皮膚病的治療，還可用于預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血后肝炎和急性肝炎的效果較為顯著。另外人體溶菌酶還可作為多種疾病的診斷指標(biāo)。
實驗試劑
固體硫酸銨；10%硫酸銨；1mol/L HCl；1mol/L NaOH； 聚乙二醇；0.15mol/L pH 6.5的磷酸緩沖液；0.1mol/L HCl；0.025mol/L KCl-0.1mol/L HAc；30% Acr/Bis；10% SDS；1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)；0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)；TEMED；10%過硫酸銨；5*Tris-Gly(pH=8.3)電泳緩沖液；2*樣品處理液；染色液；脫色液
實驗設(shè)備
精密pH試紙；布氏漏斗；磁力攪拌器；離心機(jī)；透析袋；玻璃層析柱Bio-Rad層析系統(tǒng)；Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)
實驗材料
新鮮雞蛋若干只；724型酸性陽離子交換樹脂；Sephadex G-50 ；藍(lán)色葡聚糖-2000
實驗步驟
1 實驗方法與步驟：
本實驗主要采用了724型酸性陽離子樹脂交換吸附，（NH4）2SO4鹽析、ph調(diào)節(jié)等電點去除雜蛋白，凝膠層吸分離純化，zui后用SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物等方法。
1.1 溶菌酶的制備
以蛋清為原料制備溶菌酶，采用樹脂吸附法提取溶菌酶。因溶菌酶為堿性蛋白，在近中性環(huán)境中被陽離子交換樹脂所吸附。利用該性質(zhì)，可將它與雞蛋中其他蛋白分離，然后再經(jīng)（NH4）2SO4鹽析、pH調(diào)節(jié)等電點去除雜蛋白純化處理，所得到的溶菌酶即可結(jié)晶。
1、用1mol/L HCl浸泡樹脂2h，用去離子水洗至近中性；
2、用1mol/L NaOH浸泡樹脂2h, 用去離子水洗至近中性；
3、用0.15mol/L pH=6.5的磷酸緩沖液浸泡過夜，濾后備用；
4、將2-3枚新鮮的雞蛋洗凈，空干水，敲破雞蛋小頭，再在大頭打一小孔進(jìn)氣，收集蛋清；
5、用滅菌的紗布過濾蛋清，稱量重量，置4℃冰箱預(yù)冷1h以上；
6、在不斷攪拌下，將蛋清加入處理好的樹脂中（取相當(dāng)于蛋清1/4重量的樹脂）；
7、大力攪拌（冰浴中）吸附2.5h，4℃靜置；
8、次日，3000rpm離心15min，收集樹脂，回收蛋清；
9、樹脂先用去離子水洗至洗液無混濁；
10、再用等體積的0.15mol/L pH6.5的磷酸緩沖液攪拌洗滌15min(冰浴中)，重復(fù)處理1次，zui后一次濾除樹脂水分；
11、樹脂用等體積10%的（NH4）2SO4浸泡，攪拌洗脫，每次攪拌30min，抽干，收集洗脫液。再重復(fù)洗脫一次，合并洗脫液；
12、每83mL洗脫液中加32g磨細(xì)的固體（NH4）2SO4，在攪拌下緩慢加入，待（NH4）2SO4*溶解后，4℃放置過夜；
13、次日，1000rpm離心15min，收集沉淀；
14、將上述沉淀用1mL蒸餾水分兩次洗下，裝入透析袋中；
15、置于4℃冰箱，用蒸餾水透析24h以上，其間多次換水；
16、取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl調(diào)整pH至4.6，離心，收集上清液；
17、其沉淀加少量蒸餾水?dāng)嚢瑁?/p>
18、用1mol/L NaOH調(diào)整pH到5.5，離心，棄沉淀，收集純化液；
19、將純化液裝入透析袋，用研細(xì)的聚乙二醇脫水濃縮；
1.2凝膠層析分離溶菌酶
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。
對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而*被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴(kuò)散，滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進(jìn)入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子zui后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進(jìn)入一部分凝膠的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離目的。
20、用1mol/L NaOH調(diào)整pH到5.5，離心，棄沉淀，收集純化液；
21、將純化液裝入透析袋，用研細(xì)的聚乙二醇脫水濃縮；
22、取一定量的Sephadex G-50于250mL燒杯中加入洗脫液120mL，置于室溫溶脹2-3天，反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，然后減壓抽氣去處凝膠空隙中的空氣；
23、取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上，在距柱上端約3cm處作一記號，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開出水口，液面降低至柱記號處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接受柱中去離子水，讀出的體積即為柱床體積Vt；
24、在柱中加入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿液緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1-2cm高度后打開出水口，流速一般用3-6mL/10min。膠面上升到柱記號處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等凝膠*沉降，則接上恒流泵，用1-2倍柱床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定；
25、吸取柱上端的洗脫液（注意不要攪亂液面），打開出水口，使殘余液體降至于膠面相切（足以不要干膠），關(guān)閉出水口，用細(xì)滴管吸取0.5mL（2mg/mL）藍(lán)色葡聚糖-2000，小心的繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打開出水口，等溶液滲入膠床后，關(guān)閉出水口，用少許洗脫液加入柱中，滲入膠床后，柱上端再用洗脫液充滿后用3mL/10min的速度開始洗脫。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍(lán)色葡聚糖濃度zui高點的洗脫液體積即為外水體積。藍(lán)色葡聚糖洗下來之后，還要用洗脫液（1-2倍柱床體積）繼續(xù)平衡一段時間；
26、按22的操作方法加入溶菌酶樣品溶液（0.5-1mL），以5min收集1.5mL/管的速度洗脫并收集洗脫液；
27、用Bio-Rad層析系統(tǒng)設(shè)置洗脫條件，進(jìn)行洗脫，記錄儀記錄實驗時檢測到的洗脫液在A280處的吸光值，直接描繪出洗脫曲線。合并洗脫峰內(nèi)的收集管中的洗脫液，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
1.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠鑒定分離產(chǎn)物
SDS聚丙烯酰胺凝膠采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，利用濃縮膠和分離膠濃度不同從而使分子量大小不同的蛋白質(zhì)得以篩選。
SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離笵圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，反過來孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺濃度的函數(shù)。
28、確定所需凝膠溶液的體積，配置一定體積的分離膠溶液；
29、迅速在兩玻璃板間的空隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需的空間（梳子的齒長再加0.5）。再在膠液面上面小心的注入一層水，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液；
30、分離膠聚合*后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙洗盡殘留水；
31、配制濃縮膠，在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子，將凝膠垂直放在室溫下；
32、在等待濃縮膠聚合時，可對溶菌酶樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1：1體積比加入樣品處理液，在100℃加熱5min后置于冰上，12000rpm離心3min，取10uL上清點樣；
33、待濃縮膠聚合*后，小心取出梳子，把凝膠板固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-Gly電極緩沖液；
34、將電泳裝置與電源相接，調(diào)節(jié)電壓為200V，電泳直至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部上方約1cm處，關(guān)閉電源；
35、從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板，必要時可切角作標(biāo)記；
36、用染色液體對膠進(jìn)行染色1-2h；
37、用脫色液對膠脫色1h，必要時更換多次脫色液至背景清楚，條帶清晰；
38、脫色后，可以將凝膠浸入水中保存，或?qū)δz進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥擦成膠片；
39、測量并計算溶菌酶分子量。
注意事項
要注意的具體事項和解決的問題很多，下面按照實驗步驟順序加以匯總：
第3步：磷酸緩沖液浸泡過夜時，大燒杯應(yīng)加蓋手套，可以防止蒸發(fā)。
第5步：紗布過濾前，先用玻璃棒攪勻蛋清，可以節(jié)省過濾時間。
第6步：樹脂要先經(jīng)布氏漏斗抽濾處理，得到干樹脂加入蛋清。
第11、12步：直接合并洗脫液，測量體積，不要過濾。
第17-19步：去除雜蛋白時，pH測量要準(zhǔn)確，調(diào)節(jié)要精細(xì)，因為多個收集管合并后，會因pH差異造成沉淀并產(chǎn)生不必要的電荷差異。
第23步：A)層析系統(tǒng)管道要用洗脫液先潤洗1-2遍。
B)洗脫液上柱前先要減壓抽氣，并提前準(zhǔn)備。
C)加入洗脫液后，要隨時觀察液面變化，防止干膠。
第25步：溶菌酶上樣時，吸取洗脫液到凝膠面處于干濕之間為。
第26步：層析系統(tǒng)使用完畢，管道用20%的乙醇溶液潤洗干凈，日后備用。
第34步：電泳完畢，剝膠時可切一角作標(biāo)記。
其他方面：
1.去除雜蛋白，調(diào)節(jié)pH至5.5時，NaOH使用0.1mol/L，這樣調(diào)節(jié)起來比較精細(xì)，不會產(chǎn)生的pH波動。
2.利用凝膠上樣平衡的1-2小時里，校正收集管體積，即調(diào)節(jié)Fix Size,如使1.55ml=1.00ml。
3.收集洗脫液時，可以每管1.5-2.0ml，以便于在紫外分光光度計上測量。（補(bǔ)充：如果要縮短洗脫時間，可以每管小于1ml，搜集完畢后從各管吸取250μl到96孔板中，用酶標(biāo)儀一次測量完畢。）
