兔子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫分析 試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用。 檢測范圍： 96T 20ng/L - 700ng/L 使用目的： 本試劑盒用于測定兔子血清、血漿及相關(guān)液體樣本中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)含 量。 實(shí)驗(yàn)原理 本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中兔子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)水平。用純 化的兔子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微 孔中依次加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，再與 HRP 標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (VEGF)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中 的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值）， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中兔子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)濃度。 試劑盒組成 1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 | 2 | 酶標(biāo)試劑 | 6ml×1 瓶 | 8 | 標(biāo)準(zhǔn)品（1200 ng/L） | 0.5ml×1 瓶 | 3 | 酶標(biāo)包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 1.5ml×1 瓶 | 4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 | 5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 | 6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個(gè) |
標(biāo)本要求 1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀 釋。 600ng/L | 5 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 300ng/L | 4 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 150ng/L | 3 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 75ng/L | 2 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 37.5ng/L | 1 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 150μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、 待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl， 然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。 4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復(fù) 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。 7. 溫育：操作同 3。 8. 洗滌：操作同 5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15 分鐘. 10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的
OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng) 1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。 4． 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計(jì) 算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物請避光保存。 7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 9．本試劑不同批號組分不得混用。 10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。 保存條件及有效期 1．試劑盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6 個(gè)月 |
