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免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

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一、基本原理

抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無(wú)色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來(lái)，以其達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。

幾種常用的免疫組織化學(xué)方法的原理

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

將已知抗體標(biāo)上熒光素,以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.

免疫酶細(xì)胞化學(xué)

是目前免疫組織化學(xué)研究中zui常用的技術(shù).基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位或定性研究.

免疫膠體金技術(shù)

就是用膠體金標(biāo)記一抗，二抗或其他的能特異性的結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記的定位研究.

免疫組織化學(xué)的全過(guò)程包括：①抗原的提取與純化;③免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化;③將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體;④標(biāo)本的制備;③免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng);⑧觀察結(jié)果。

二、免疫組織化學(xué)基本技術(shù)

1.材料

免疫組織化學(xué)可用于多種材料.如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,人體組織,細(xì)胞和體外培養(yǎng)細(xì)胞都可用于免疫組化研究.

一.)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui為常用.關(guān)鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分.

二.)人體材料　包括活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及通過(guò)各種手段收集的細(xì)胞都可用于免疫組化研究.如　脫落細(xì)胞　穿刺涂片　骨髓涂片　血涂片等.

三.)體外培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本　根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性采用不同的方法.對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部放置載玻片，讓細(xì)胞在其上面生長(zhǎng)，到時(shí)將載玻片取出進(jìn)行固定，染色.懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用離心涂片或離心后細(xì)胞團(tuán)塊固定，脫水，包埋，切片的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。

2 .固定

固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽(yáng)性，假陰性的結(jié)果.

選擇固定方法的原則是:

在保持組織形態(tài)的完好和被檢測(cè)抗原的前提下,盡量應(yīng)用濃度zui低的固定劑及zui短的固定時(shí)間.

常用固定劑

一.)醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯(lián),將抗原保存在原位.此類固定劑的特點(diǎn)是對(duì)組織的穿透力強(qiáng),組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯(lián)合使用.

(1)3% 中性甲醛固定液液:

配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

特點(diǎn): 滲透性好,能完好地保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和某些抗原.由于交 聯(lián)作用會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性,會(huì)遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原決定簇.

(2)4%多聚甲醛緩沖液:

配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS, 使總?cè)萘繛?000ml

特點(diǎn)：此固定劑對(duì)抗原的保護(hù)優(yōu)于甲醛緩沖液但價(jià)格高與甲醛

(3)戊二醛-多聚甲醛緩沖液

配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.

特點(diǎn)：多用于電鏡的免疫組織化學(xué)研究

(4)Bouin液

配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.

特點(diǎn)：穿透力強(qiáng)，組織收縮小. 比單獨(dú)用甲醛固定更適合于免疫組織化學(xué)研究

(5) PLP液 (過(guò)碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)

此固定劑比較適合富含糖類組織的固定,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的保存均較好, 但配制比較繁瑣

二.)丙酮及醇類固定劑

固定原理是使組織中的蛋白質(zhì)和糖類沉淀.此類固定劑的穿透能力強(qiáng),對(duì)抗原保存較好,但對(duì)小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存效果較差.常與其他固定劑 如 冰醋酸,乙醚,氯仿等混合使用.

(1)AAA液: 純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml

(2)Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定

(3)Carnoy液: 純酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預(yù)冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.

三.)其他固定劑

(1) Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測(cè)。

(2) 四氯化鋨液 是電鏡研究中所必需的固定液

選擇*固定劑的標(biāo)準(zhǔn)是：

組織形態(tài)保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用zui廣的固定劑。

3. 包埋

包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機(jī)切片.常見(jiàn)的包埋劑及方法如下:

石蠟包埋 石蠟是組織病理切片中zui常用的包埋劑. 需要脫水, 透 明,浸臘等過(guò)程.

冰凍包埋 是作冰凍切片的包埋方法. 新鮮的及以固定的材料均 適合于冰凍包埋. 常用的包埋劑是OCT

塑料包埋 常用的是環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑. 優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以作光鏡和 電鏡觀察

碳臘包埋 較少用.包埋劑為聚乙二醇

4. 切片

因?yàn)槊庖呓M化的步驟較多, 要求切片薄而且平整, 否則在染色過(guò)程中容易脫片.一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

(1)洗片 酸液浸泡過(guò)夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸

泡 2h，擦干。

(2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。

使用方法見(jiàn)試劑使用說(shuō)明書(shū)。

三、常用的免疫組織化學(xué)方法

自從1941年Coons及其同事*免疫組織化學(xué)技術(shù)以來(lái)，伴隨著免疫學(xué)和組織化學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，從zui初的直接法, 到現(xiàn)在的各種間接法的發(fā)展, 免疫組織化學(xué)發(fā)生了日新月異的變化.現(xiàn)在就從zui初的直接法開(kāi)始到現(xiàn)在常用的免疫組織化學(xué)方法作一簡(jiǎn)單介紹.

一. ）直接法: 是zui早出現(xiàn)的方法,是將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上,與標(biāo)本中的抗原結(jié)合,讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì),可以在光鏡下檢測(cè). 直接法放大作用小,不夠敏感, 且標(biāo)記一種抗體只能檢測(cè)一種抗原,所以應(yīng)用就受到了限制.

二. ）間接法

是將酶標(biāo)記在第二抗體上,形成抗原/一抗 /二抗-酶復(fù)合物,zui后酶底物顯色來(lái)放大信號(hào). 由于一抗多來(lái)源于兔,小鼠或山羊等有限的幾種動(dòng)物,所以僅需制備酶標(biāo)記的一抗來(lái)源的IgG就可以檢測(cè)很多的抗體,放大效果也有所提高.為了追求更大的放大效果,人們有發(fā)明了PAP的橋聯(lián)法,雖然敏感性有所提高,但是同時(shí)出現(xiàn)了較高的非特異性背景,及假陽(yáng)性等問(wèn)題.隨后被生物素-卵白素系統(tǒng)所取代。

三. ）生物素-卵白素系統(tǒng) (親和免疫組織化學(xué))

生物素(biotin)是一種244Da的小分子的維生素。卵白素(avidin)又稱作抗生物素是一種68kDa的糖蛋白。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親合力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)，生物素和抗生物素都具有與其他示蹤劑，如熒光素，過(guò)氧化物酶等相結(jié)合的能力。近年來(lái)，應(yīng)用這一系統(tǒng)特性，研制出了許多檢測(cè)方法，如ABC法，SP法等。