信帆生物為你答疑解惑：凝血酶的產(chǎn)品應(yīng)用，凝血酶的標(biāo)簽切割
更新時間：2018-03-19 點(diǎn)擊次數(shù)：2819次信帆生物為你答疑解惑：凝血酶的產(chǎn)品應(yīng)用，凝血酶的標(biāo)簽切割
凝血酶（Thrombin）
規(guī)格：10000U
保存：2-8℃保存，有效期3 年。
溶解方法：
可用生理鹽水（0.9% NaCl溶液）配制，儲存液參考濃度為1000U/ml，-20℃保存可穩(wěn)定6個月。
為避免反復(fù)凍融，可分裝凍存。
產(chǎn)品應(yīng)用：
一、凝血實(shí)驗(yàn)
凝血酶（Thrombin）來源于牛血漿，分子量37KD，是由兩條肽鏈（31KD 和6KD）通過二硫鍵
組成的。凝血酶是凝血酶原（凝血因子Ⅱ）激活后形成的蛋白質(zhì)水解酶，其催化纖維蛋白原
（fibrinogen）水解掉A 肽和B 肽，由此形成纖維蛋白單體，單體進(jìn)一步聚合，在血小板、紅細(xì)胞
和白細(xì)胞等參與下形成血凝塊。
凝血酶酶活：固體活力：50-200 單位/mg solid；比活力：比活力大于2000 單位/mg protein；
酶活檢測方法：以纖維蛋白原為底物，按2010 版藥典凝血酶凍干粉檢測。
產(chǎn)品穩(wěn)定性好：凍干產(chǎn)品在室溫條件下考察12 個月，酶活力未見顯著變化，冷藏條件下保存
36 個月，酶活力未見顯著變化。
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二、標(biāo)簽切割
由于凝血酶具有切割序列專一性強(qiáng)，水解效率高的特點(diǎn)，它也被廣泛地應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的
開發(fā)，其應(yīng)用之一是作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂，尤其適用于生物工程制藥
業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
凝血酶是一種廣泛用于切割標(biāo)簽的蛋白酶，凝血酶切割位點(diǎn)是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',這里
X4 和X3 是疏水氨基酸而X1'和X2'是非酸性氨基酸，一些經(jīng)常使用的識別位點(diǎn)是
L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和M-Y-P-R-G-N。在X4-X3-P-R-G-X2'之間切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更
有效。其他識別位點(diǎn)是X2-R[K]-X1', 這里X2 或者X1'是甘氨酸，例如A-R-G 和G-K-A，這里切
割發(fā)生在第二個殘基后。在凝血酶切割位點(diǎn)和N 末端標(biāo)簽之間插入五個甘氨酸殘基可改善切，通過
這一"甘氨酸連接肽"只需較少酶量就可達(dá)到*切割，而且也可以避免可能發(fā)生的錯誤切割。
作為切割標(biāo)簽的蛋白酶具有以下特點(diǎn)：
1. 純度高：SDS-PAGE 檢測圖譜無雜蛋白條帶；
2. 不含有其他蛋白酶活性；
3. 酶切活性高，能夠有效切質(zhì)量比為1:1000 的蛋白。切割可在20℃到37℃之間切割0.3 到16 小
時。
4. 有效的酶切緩沖液是20mM Tris-HCl 緩沖液,含150mM 氯化鈉，pH8.0。
5. 凝血酶可從切割產(chǎn)物中用p-氨基瓊脂糖親和純化,或者苯甲脒瓊脂糖移去。
酶切條件：
凝血酶酶切條件舉例：20mM Tris-HCl緩沖液，含150mM NaCl，pH8.0體系中：
融合蛋白總量100μg
凝血酶用量0.2-0.3U
溫度20℃-37℃
酶切時間0.3h-16h
根據(jù)底物蛋白酶切位點(diǎn)的差異，可以適當(dāng)調(diào)整凝血酶的工作濃度與酶切時間，以便達(dá)到較好的
酶切效果。
凝血酶切割樣品SDS-PAGE 比較圖譜：
泳道1 為切割前樣品，泳道2 為采用sigma 凝血酶切割后樣品，泳道3、4 為采用
sigma 凝血酶切割后樣品，泳道5、6 為采用自制凝血酶切割后樣品。
SDS-PAGE 圖譜：泳道1 為自制凝血酶（非還原），泳道2 為sigma 公司凝血酶（非還原）；泳道3
為自制凝血酶（還原），泳道4 為sigma 公司凝血酶（還原）
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