石蠟切片免疫組化和免疫熒光實驗操作詳解
更新時間：2019-07-23 點擊次數(shù)：6388次石蠟切片免疫組化和免疫熒光實驗操作詳解
上海信帆生物提供免疫組化和免疫熒光實驗代測。
一般流程
1. 用聚乙.烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 小時。
2. 用無菌水充分漂洗蓋玻片 3 次，每次 1 小時。
3. 充分干燥蓋玻片，在紫外光下滅菌至少 4 小時。
4. 使細胞在玻璃蓋玻片上生長，或制備 Cytospin 或涂片制備物。
5. 用磷酸鹽緩沖液 (PBS) 簡單漂洗。
使用 1 × PBS 0.1% Tween 20 作為洗滌緩沖液。
固定
可使用以下兩種方法中的一種固定細胞：
1. 室溫下，在 100% 甲醇（-20 ℃ 冷凍）中孵育細胞 5 分鐘。
2. 室溫下，在 4% 多聚.甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育細胞 10 分鐘。
用冰 PBS 洗滌細胞 3 次。
抗原修復（可選步驟）
在抗原修復緩沖液對細胞進行加熱處理后，有些抗體的效果會更好。查看產(chǎn)品信息，了解每種一抗的使用建議。
1. 將抗原修復緩沖液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）預熱至 95 ℃。具體方法為：將裝有緩沖液的蓋玻片染色缸置于水浴鍋中，水浴鍋的溫度設(shè)為 95 ℃。
2. 用小型寬頭鑷子小心將蓋玻片置于蓋玻片染色缸內(nèi)的抗原修復緩沖液中，記下長有細胞的蓋玻片面。
3. 在 95 ℃ 下加熱蓋玻片 10 分鐘。
4. 從抗原修復緩沖液中取出蓋玻片，浸
入 6 孔組織培養(yǎng)板內(nèi)的 PBS 溶液中，保持長有細胞的一面朝上。
5. 用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
通透
如果靶蛋白位于細胞內(nèi)，對細胞進行通透處理尤為關(guān)鍵。用丙.酮固定的樣品不需要進行通透處理。
1. 用 PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育樣品 10 分鐘。Triton X-100 是用于提高抗體滲透性常用的去垢劑。但 Triton X-100 會破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜抗原。
2. 確定每種目標蛋白的 Triton X-100 比例。
3. 用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
封閉與免疫染色
1. 用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細胞 30 分鐘，封閉抗體的非特異性結(jié)合（可替代的封閉液包括 1% 明膠或來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清：查看抗體數(shù)據(jù)表了解相關(guān)建議）。
2. 室溫下，用稀釋抗體（溶于 1% BSA 的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。
3. 倒出溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
4. 室溫下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。
5. 倒出二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
多色染色（可選步驟）
要檢測同一個樣品中兩種或多種抗原的共同分布情況，需要使用雙重免疫熒光流程。該流程可在混合物中同時進行檢測，也可逐個抗原依次進行檢測。
確保抗體來源于不同物種并且這些抗體有相應的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗體和抗抗原 B 的鼠抗體。也可使用偶聯(lián)至不同熒光團的直標一抗。
同時孵育
1. 用封閉液孵育細胞 30 分鐘。
2. 室溫下，用兩種一抗（溶于 1% BSA 的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。
3. 倒出溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
4. 室溫下，用兩種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。
5. 倒出二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
依次孵育
1. 封閉步驟：室溫下，用封閉液（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）孵育細胞 30 分鐘。
2. 室溫下，用種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中）在濕盒中孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育（一抗溶于 1% 明膠或 1% BSA 的 PBST 中）。
3. 倒出種一抗溶液，用 PBS 洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
4. 室溫下，用種二抗（溶于 1% BSA 的 PBST 中）避光孵育細胞 1 小時。
5. 倒出種二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
6. 第二封閉步驟：室溫下，用第二種血清（來源于產(chǎn)生二抗的物種的 10% 血清）避光孵育細胞 30 分鐘。
7. 室溫下，用第二種一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 中）在濕盒中避光孵育細胞 1 小時，或 4 ℃ 過夜孵育。
8. 倒出第二種一抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
9. 室溫下，用第二種二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育細胞 1 小時。
倒出第二種二抗溶液，用 PBS 避光洗滌細胞 3 次，每次 5 分鐘。
如需檢測兩種以上的抗原，其余抗體按照步驟 1–5 繼續(xù)操作。
復染
1. 用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育細胞 1 分鐘。
2. 用 PBS 漂洗細胞。
封片
1. 用一滴封片介質(zhì)封閉蓋玻片。
2. 用指甲油密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動。
3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存
| 實驗步驟 | 1. 石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。
2. 取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復的，視具體情況而定）
3. 每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。
4. 除去PBS液，每張切片加1滴相應的抗體（相應稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時。
5. PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。
6. 除去PBS液，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。
7. 除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察5分鐘。
8. 蘇木素復染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。 展開 |
|---|---|
| 注意事項 | 1. 在切片加上一抗后，第二抗體標記多聚螯合物酶（HRP）的復合物與一抗結(jié)合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號有顯著的放大，其敏感性較SABC、SP法高。
2. 由于多聚物在體內(nèi)不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。
3. 辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗，減少了實驗步驟，且試劑孵育時間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡單，實驗時間比SABC、SP法大為縮短。 展開 |
| 其他 | 一、特點
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