1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒

( 貨號(hào): A151-1-1 分光光度法 25 管/24 樣)

一、測(cè)定意義：

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控制著 CO2的固定，同時(shí)又制

約著碳素向 Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

二、測(cè)定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與 1 分子的 CO2結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸

甘油酸(PGA)，PGA 可通過(guò)外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，

并使還原型輔酶Ⅰ(NADH)氧化。因此，340nm 吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶Ⅰ氧化速率，還原型輔酶

Ⅰ氧化速率可反映 Rubisco 的活性。

三、自備的儀器和用品：

可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

四、試劑的組成和配制：

提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存，臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑分裝后-20℃

保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存，臨用前加入 12.5mL 試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑分裝后-20℃

保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存，臨用前加入 1.25mL 試劑一，充分混勻備用，用不完的試劑分裝后-20℃

保存，禁止反復(fù)凍融；

（注意：試劑二、三、四溶解后，按需分裝-20℃保存。）

五、樣本的前處理：

1、總 Rubisco 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，

破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

2、胞漿和葉綠體 Rubisco 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議

稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，分離并保留沉淀，取上

清在 4℃，8000g 下離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 Rubisco 酶活性；取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩

溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取

上清測(cè)定葉綠體中 Rubisco 酶活性。

建議測(cè)定總 Rubisco 酶活性，按照步驟 1 提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 Rubisco，則按照

步驟 2 提取粗酶液。（注意：粗酶液制備過(guò)程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。）

六、測(cè)定步驟

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定：

（1）工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三 1:1 混合，用多少配多少；

（2）在 1mL 石英比色皿中，加入 50μL 樣本、50μL 試劑四和 900μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處

20s 時(shí)吸光值 A1 和 5min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算△A=A1-A2。

七、Rubisco 活性計(jì)算：

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算(此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購(gòu)本公司生產(chǎn)的 BCA 法蛋白濃度

測(cè)定試劑盒)

單位的定義：25℃中 1mg 蛋白 1min 氧化 1nmolNADH 為一個(gè)酶活力單位。

Rubisco（nmol/min/mg prot）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷（V 樣×Cpr）÷T

=643×△A÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中 1g 組織 1min 氧化 1nmolNADH 為一個(gè)酶活力單位。

Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T

=643×△A÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10 -3 L；

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3 L/mol/cm；

d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05mL；

V 樣總：加入提取液體積 1mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，5min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g。

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒